多光子顯微鏡

在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發(fā)波長(zhǎng)照射樣品。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢愿畹卮┩笜悠愤M(jìn)行 3D 成像，并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損壞樣品，從而延長(zhǎng)樣品壽命。為了實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā)，照明光束在空間上聚焦（使用光學(xué)器件），同時(shí)使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(gè)（或更多）光子同時(shí)到達(dá)同一位置（即熒光團(tuán)分子）的概率。

多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生 (SHG)、三次諧波產(chǎn)生 (THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜 (CARS) 和受激發(fā)射耗盡 (STED) 顯微技術(shù)。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠最大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要，并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低 GDD 特性。

如圖 2 所示，典型的系統(tǒng)由激發(fā)激光器、掃描和成像光學(xué)器件、靈敏檢測(cè)器（通常是光電倍增管）和用于將熒光與激光器分離并阻擋激光的濾光片（二向色分光鏡）組成從到達(dá)檢測(cè)器（發(fā)射濾光片）。

多光子成像系統(tǒng)提供的優(yōu)勢(shì)包括真正的三維成像、對(duì)活組織內(nèi)部深處進(jìn)行成像的能力以及消除平面外熒光。

使用這種方法，可以對(duì)斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進(jìn)行成像，甚至可以對(duì)樣品或組織中固有的熒光分子進(jìn)行成像。多光子成像的缺點(diǎn)包括需要高峰值功率脈沖激光器，例如鎖模鈦：藍(lán)寶石激光器，并且直到現(xiàn)在，缺乏在整個(gè)發(fā)射范圍內(nèi)提供足夠吞吐量的高性能濾光片。整個(gè)激光調(diào)諧范圍內(nèi)的興趣和足夠的阻擋（圖 3）。

圖 1：來(lái)自暴露的小鼠皮層的雙色體內(nèi)雙光子成像。NADH 熒光（紅色）和硫羅丹明標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞（綠色）使用 BrightLine FF01-680/SP 發(fā)射器和 FF665-Di01 二向色鏡拍攝。圖片由羅徹斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科系 Karl A. Kasischke 和 Nikhil Mutyal 提供。

圖 2：多光子熒光顯微鏡的典型配置。

圖 3：多光子顯微鏡需要在非常寬的光譜范圍內(nèi)控制光：從近紫外一直到近紅外。

針對(duì)多光子顯微鏡優(yōu)化的 Semrock 濾光片Semrock 通過(guò)引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片，為多光子用戶帶來(lái)了增強(qiáng)的性能?？紤]到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復(fù)雜元件通常需要多少投資，這些新的光學(xué)濾光片代表了一種簡(jiǎn)單且廉價(jià)的升級(jí)，可以顯著提高系統(tǒng)性能。

BrightLine^®
發(fā)射濾光片提供從近紫外到近紅外的清晰透射（圖 4）。事實(shí)上，與傳統(tǒng)濾光片的褐色色調(diào)相比，發(fā)射濾光片看起來(lái)像窗戶玻璃一樣清晰，而且 LWP 二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來(lái)像高反射鏡（圖 5）。發(fā)射濾光片還在 Ti:Sapphire 激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)高信噪比和測(cè)量靈敏度至關(guān)重要。

有時(shí)需要限制在任何給定時(shí)間檢測(cè)到的熒光發(fā)射光譜帶，特別是當(dāng)使用多個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記樣品中的不同目標(biāo)時(shí)。較窄的帶通濾光片非常適合此目的，Semrock 提供了多種此類帶通濾光片，可與多光子發(fā)射濾光片結(jié)合使用，幾乎不會(huì)丟失熒光信號(hào)。

由于非線性光學(xué)效應(yīng)強(qiáng)烈依賴于激光脈沖的峰值強(qiáng)度，因此當(dāng)脈沖展寬（以及隨之而來(lái)的峰值強(qiáng)度降低）保持在最/低限度時(shí)，會(huì)產(chǎn)生*的成像。BrightLine FF670-SDi01 和 FF720-SDi01 短波通二向色分束鏡旨在將激發(fā)激光反射到樣品，同時(shí)提供返回的近紫外和可見(jiàn)熒光或 SHG 信號(hào)的出色傳輸。與從這些分束鏡反射的激光相關(guān)的群延遲色散 (GDD) 非常低。例如，對(duì)于 FF670-SDi01 濾光片，100 fs 變換限制高斯脈沖在整個(gè)激光波長(zhǎng)范圍內(nèi)的加寬小于 2%，而對(duì)于 FF720-SDi01 濾光片在整個(gè)激光波長(zhǎng)范圍內(nèi)的加寬遠(yuǎn)小于 1%。

圖 4：BrightLine 多光子濾光片提供近乎理想的性能，如“近紫外和可見(jiàn)光"發(fā)射濾光片 FF01-680/SP 和二向色鏡 FF665-Di01 的這些典型測(cè)量光譜所示。

圖5：圖 5： BrightLine 多光子濾光片非常清晰！

圖6：使用Semrock多光子濾光片研究表明熒光Ca 2+指示劑蛋白（FCIPs），用于在使用雙光子顯微鏡活細(xì)胞研究的Ca2 +動(dòng)態(tài)的功率。表達(dá)熒光蛋白 CerTN-L15 的 2/3 層神經(jīng)元的三維重建。

中間：3 張選定的圖像（每張?jiān)谧髠?cè)和右側(cè)分別用數(shù)字標(biāo)記的深度拍攝）。圖片由慕尼黑工業(yè)大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所的 Olga Garaschuk 教授教授提供。（修改自 Heim 等人，Nat. Methods，4(2)：127-9，2007 年 2 月。）(Modified from Heim et al., Nat. Methods, 4(2): 127-9, Feb. 2007.)

光密度OD

光學(xué)密度（Optical Density或稱為 OD）是描述光通過(guò)高度阻擋的光學(xué)濾光片（當(dāng)光的傳輸非常小時(shí)）的透過(guò)率的一種方便工 具。OD簡(jiǎn)單地定義為對(duì)數(shù)（底為10）的負(fù)變量。變量在0和1之間變化(OD = – log10(T))。因此，透過(guò)率就簡(jiǎn)單等于10的負(fù)OD值的 方 (T = 10– OD)， 左圖顯示了OD的影響：6個(gè)數(shù)量級(jí)（1000000次）的透過(guò)率變化，非常簡(jiǎn)單地用介于0到6的數(shù)字來(lái)表示；下面中間 的示例表和右下的“法則"列表提供了一些方便的技巧，可以在 OD 和透過(guò)率之間快速轉(zhuǎn)換。將變量 T 乘以2（或除以10）等于減 去0.3（或加上1），就轉(zhuǎn)換成了 OD 。

光密度本底噪聲：

通過(guò)精心優(yōu)化我們的測(cè)量設(shè)備和方法，Semrock能夠提供一些優(yōu)化的寬帶光密度（OD）。以下是此網(wǎng)站上顯示的大多數(shù)測(cè)量數(shù)據(jù)的典型OD噪聲本底限制。

對(duì)于介于320和1120 nm之間的波長(zhǎng)，接近或低于3e-7（光學(xué)密度6.5）的透射值受到測(cè)量噪聲的限制。

對(duì)于波長(zhǎng)<320 nm且在1120-1500 nm之間的波長(zhǎng)，接近或低于3e-6（光學(xué)密度5.5）的透射值受到測(cè)量噪聲的限制。

對(duì)于大于1500 nm的波長(zhǎng)，接近或低于1e-5（光學(xué)密度5.0）的透射值受到測(cè)量噪聲的限制。

同樣，對(duì)于某些濾光片和/或某些阻擋波長(zhǎng)范圍，顯示的本底噪聲僅為OD 4。